جلد 10 - Summer 2008-                   جلد 10 - Summer 2008- صفحات 0-0 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Karimi M H, Soheila Soheili Z, Pourfathollah A A, Samiei S, Moazzeni S M, Ataee Z, et al . Designing of relative quantitative Real-Time PCR for detection of CD40 gene expression in dendritic cell after suppression with antisense. MJMS. 2008; 10
URL: http://journals.modares.ac.ir/article-30-8801-fa.html
کریمی محمدحسین، سهیلا سهیلی زهرا، پورفتح‌اله علی‌اکبر، سمیعی شهرام، مؤذنی سید محمد، عطائی زهرا، و همکاران. و همکاران.. طراحی روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD40 در سلول‌های دندریتیک پس از مهار با آنتی‌سنس. پژوهش‌های آسیب‌شناسی زیستی. 1386; 10 ()

URL: http://journals.modares.ac.ir/article-30-8801-fa.html


1- گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
2- گروه بیوشیمی، مرکز تحقیقات مهندسی ژنتیک و زیست فن‌آوری، تهران، ایران
3- استاد، گروه ایمونولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
4- مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران
5- مرکز تحقیقات پیوند و ترمیم اعضا، بیمارستان نمازی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران
6- گروه زیست‌شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون، کازرون، ایران
چکیده:   (3846 مشاهده)
هدف: سلول‌های دندریتیک در تنظیم وکنترل پاسخ‌های ایمنی نقش مهمی به عهده دارند. امروزه نظر بر این است که از این سلول‌ها در درمان بسیاری از بیماری‌ها می‌توان استفاده کرد. یکی از راه‌های ایمونوتراپی ایجاد سلول‌های دندریتیک تولروژن از طریق ممانعت از بیان مولکول‌های کمک تحریکی است.CD40 یکی از مولکول‌های کمک تحریکی بوده که با ممانعت از بیان آن از طریق روش‌هایی مانند آنتی‌سنس یا SiRNA می‌توان به این مهم (سلول‌های دندریتیک تولروژن) دست پیدا کرد. با تولید سلول‌های دندریتیکی تولروژن می‌توان افقی روشن در درمان بسیاری از بیماری‌ها ایجاد نمود و با طراحی RT-PCR کمی برای اندازه‌گیری میزان بیان می‌توان راه را برای ایجاد این سلول‌ها هموار نمود. در این تحقیق با طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزارهای مربوط و منتقل کردن آن به سلول‌های دندریتیکی با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ (Invitrogen) به سلول دندریتیک تولروژن رسیده‌ایم. مواد و روش‌ها: در این مــطالعه سـلول‌های دندریتیک از طحال موش Balb/c جـدا شد و مــیزان خلوص به وسـیله فـلوسیتومتری بر اساس نشانگر CD11Cتعیین شد. رده سلولیBCL1 به‌عنوان گـروه کنترل، بیان‌کننده CD40 در مـحیط کـشت FCS 10% RPMI-1640+ کـشت داده شـدند. با اســتفاده نـرم‌افــزارهای بیوانفورمــاتیک Beacon Designer و mfold and Blast آغــازگر برای ) GADPHبه عـنوان کـنترل داخـلی) و CD 40 طراحی شد، کیت RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت و با تعیین O.D280/260 و الکترفورز در آگارز مـیزان خلوص تعیین شد. در ادامه کار ابتدا PCR کیفی با استفاده از آنزیم Fast Hot Start Taq (Roche) بهینه شد و سپس بعد از ساخت cDNA با استفاده از کیت IQ sybergreen (Biorad)،RT-PCR کمی برای CD40 بهینه و در نهایت با استفاده از همین کیت منحنی استاندارد پس از تهیه رقت‌های مناسب از RNA برای CD40 و کنترل داخلی محاسبه شد. پس از طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزار‌های بیوانفورماتیک با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ انتقال، انجام و با استفاده از RT-PCR کمی میزان کاهش بیان ژن مشخص شد. نتایج: دمای بهینه اتصال با استفاده ازشیب Real time PCR و بهترین CT و Rn∆ در 5/95 درجه سانتی‌گراد برای هر دو ژن CD40 و GADPH تعیین و همچنین دمای ذوب PCR حدود 84 درجه سانتی‌گراد مشخص شد. شیب و بازدهی واکنش PCR برای ژن‌های CD40 و GADPH با روش رقت سریال تعیین شد. با استفاده از غلظت نابرابر آغازگرها بازدهی و شیب برابری این دو ژن با دمای اتصال یکسان تعیین شد. (بازده CD40: 5/96، شیب: 408/3- ؛ بازده GADPH: 1/94، شیب: 471/3-) میزان کاهش بیان ژن پس از انتقال با آنتی‌سنس 64/1در سلول‌های دندریتیکی و در رده سلولی BCL132/1 تعیین شد. ماده منتقل شده تأثیری روی بیان ژن ندارد. بهترین زمان برای اندازه‌گیری کاهش بیان ژن CD40 48 ساعت پس از انتقال در سلول‌های دندریتیکی و رده سلولی BCL1 است. نتیجه‌گیری: در مطالعات مختلف از روش‌های متفاوتی مانند RT-PCR نیمه کمی RT-PCR کمی مطلق و RT-PCR کمی نسبی برای تعیین میزان بیان ژن‌های مختلف ازجمله CD40 استفاده شده است. بررسی‌ها در این تحقیق نشان داد که استفاده از کیت IQ–sybergreen (Biorad) و الیگومر دی‌اکسی تیمیدین برای سنتز cDNA برای رسم منحنی استاندارد ژن CD40 بسیار مناسب است (در این مورد GADPH کنترل داخلی مناسبی است) که در مقایسه با RT-PCR نیمه کمی دقیق‌تر و قابل اعتمادتر است.
واژه‌های کلیدی: : سلول‌های دندریتیک
متن کامل [PDF 365 kb]   (2033 دریافت)    

دریافت: ۱۳۸۶/۶/۶ | پذیرش: ۱۳۸۶/۶/۶ | انتشار: ۱۳۸۶/۶/۶

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA code