Pathobiology Research
Pathobiology Research
mjms
Medical Sciences
http://mjms.modares.ac.ir
1
admin
2538-3000
2538-5887
en
jalali
1397
4
1
gregorian
2018
7
1
21
2
online
1
fulltext
fa
بیان و تخلیص ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E نوترکیب از یک ژن صناعی
Expression and Purification of Recombinant Catalytic Domain of Botulinum Neurotoxin Type E from a Synthetic Gene
<div style="text-align: justify;"><span style="font-family:iransharp;"><strong><span style="font-size:12.0pt;">اهداف</span></strong>: <span style="font-size:12.0pt;">نوروتوکسینهای بوتولینوم، از قویترین سمهای شناختهشده هستند که با مهار آزادسازی میانجی عصبی استیلکولین، موجب ایجاد فلج شل عضلانی میشود. طراحی مهارکنندهها هنوز بهعنوان یک راهبرد اصلی برای مهار درونسلولی مسمومیتهای ناشی از سموم مذکور بهشمار میآید. برای بررسی پتانسیل عملکرد مهارکنندههای طراحیشده، به سم خالص یا ناحیه کاتالیتیک آن نیاز است. هدف مطالعه حاضر، بررسی بیان و تخلیص ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E</span></span> <span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">BoNT/E)</span></span><span style="font-size:10.0pt;">)</span> <span style="font-size:12.0pt;">نوترکیب از یک ژن صناعی</span> <span style="font-size:12.0pt;">بود.</span><span style="font-size:16.0pt;"></span><br>
<strong><span style="font-size:12.0pt;">مواد و روشها</span></strong><span style="font-size:12.0pt;">: در مطالعه تجربی حاضر، توالی زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> از بانک ژن بهدست آمد و بهینهسازی کدونی براساس </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E</span></span></em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">. <em>coli</em> BL۲۱</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> انجام شد. سایر بررسیهای بیوانفورماتیک لازم برای بیان بهتر ژن صورت گرفت. توالی ژن برای سنتز و همانندسازی در وکتور </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">pET۲۸a(+)</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> سفارش داده شد. وکتور نوترکیب داخل باکتری </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E.</span></span></em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;"> <em>coli</em> BL۲۱</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> انتقال و بیان پروتئین با </span><em><span style="background:white;"><span style="color:black;"><span style="font-size:12.0pt;">ایزوپروپیلتیو-بتا-دیگالاکتوزیداز</span></span></span></em> <span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">(IPTG)</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> القا شد. برای بیان محلول، در شرایط بیانی تغییر صورت گرفت. سپس بهوسیله کروماتوگرافی تمایلی و فیلتر آمیکون پروتئین خالصسازی شد. برای بررسی بیان و خالصسازی پروتئین </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">SDS-PAGE</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> و برای تایید پروتئین بیانشده تکنیک وسترنبلات بهکار رفت.</span><br>
<strong><span style="font-size:12.0pt;">یافتهها</span></strong><span style="font-size:12.0pt;">: شاخص سازگاری کدون ژن به ۰/۸۵ افزایش یافت. ساختار سوم پیشبینیشده کیفیت مناسب را نشان داد</span><span dir="LTR"><span style="font-size:12.0pt;">.</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> ساختار </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mRNA</span></span> <span style="font-size:12.0pt;">نشان داد، ساختار پیشبینیشده پایدار بود. بیان محلول پروتئین در شرایط </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">°C</span></span><span style="font-size:12.0pt;">۱۸ بهمدت ۱۸ساعت با القای </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">IPTG</span></span><span style="font-size:12.0pt;">، یکمیلیمولار بهدست آمد. تولید پروتیئن و با خلوص بالای ۹۰% تایید شد.</span><br>
<strong><span style="font-size:12.0pt;">نتیجهگیری</span></strong><span style="font-size:12.0pt;">: بهینهسازی شرایط بیان پروتئین زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E</span></span> <span style="font-size:12.0pt;">موجب تولید محلول آن در محیط کشت توسط میزبان </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E.</span></span></em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;"> <em>coli</em> BL۲۱</span></span><span style="font-size:12.0pt;"> میشود.</span><span style="font-size:12.0pt;"></span></span></div>
<div style="text-align: justify;"><strong>Aims</strong>: Botulinum neurotoxins are the strongest known bacterial toxins that cause muscle paralysis due to inhibition of acetylcholine release. Design of inhibitors is still pursued as a major strategy for intracellular inhibition of poisoning caused by these toxins. Investigation of the potential function of design inhibitors, pure poison or catalytic area is essential. The aims of present study were expression and purification of recombinant catalytic domain of botulinum neurotoxin type E (BoNT/E) Type E from a synthetic gene.<br>
<strong>Materials and Methods: </strong>In this experimental study, the sequence of the botulinum neurotoxin type E light chain was adopted from GeneBank and codons were optimized according to E.<em>coli</em> BL21 (DE3) codon usage. Other bioinformatics tools were exploited to reach the optimum expression of the gene in the mentioned host. The resultant (gene) was then ordered to synthesize and cloning in pET28a (+) expression vector. The recombinant vector was transferred into E. coli BL21 (DE3) host cells. The expression of the protein was induced by addition of IPTG. The expression conditions were changed to obtain a soluble expression of the protein. Then, the protein was purified by an affinity chromatography, followed by a further purification with amicon filter. SDS-PAGE was used to evaluate expression and purification of the protein and Western blotting was performed to confirm the expressed protein.<br>
<strong>Finding:</strong> Codon Adaptation Index of the gene increased to 0.85. The third predicted structure showed good quality. The thermodynamic analysis of the mRNA structure showed that the predicted structure is stable. The soluble expression was obtained in 18°C and 18h induction by 1 mM IPTG. Protein production with higher more than 90% purity was confirmed.<span dir="RTL"></span><br>
<strong>Conclusion:</strong> Optimization of the protein expression conditions resulted in producing the solution in the culture medium by E. coli BL21 as host.</div>
توکسین بوتولینوم تیپ E, زنجیره سبک, ناحیه کاتالیتیک, پروتئینهای نوترکیب
Botulinum toxin Type –E, Immunoglobulin Light Chain, Catalytic Domain, Recombinant Proteins
79
84
http://mjms.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-30-19930-1&slc_lang=fa&sid=30
S.M.
Aghaie
سیدمجتبی
آقایی
100319475328460097012
100319475328460097012
No
Biological Research Department, Basic Sciences Faculty, Imam Hossein University, Tehran, Iran
گروه تحقیقات زیستشناسی ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
S.J.
Mosavi
سیدجعفر
موسوی
jmosavi@ihu.ac.ir
100319475328460097013
100319475328460097013
Yes
Biological Research Department, Basic Sciences Faculty, Imam Hossein University, Tehran, Iran
گروه تحقیقات زیستشناسی ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
F.
Ebrahimi
فیروز
ابراهیمی
100319475328460097014
100319475328460097014
No
Biological Research Department, Basic Sciences Faculty, Imam Hossein University, Tehran, Iran
گروه تحقیقات زیستشناسی ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
M.B.
Salehi
محمدباقر
صالحی
100319475328460097015
100319475328460097015
No
Biological Research Department, Basic Sciences Faculty, Imam Hossein University, Tehran, Iran
گروه تحقیقات زیستشناسی ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
Sh.
Nazarian
شهرام
نظریان
100319475328460097016
100319475328460097016
No
Biological Research Department, Basic Sciences Faculty, Imam Hossein University, Tehran, Iran
گروه تحقیقات زیستشناسی ، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران