Pathobiology Research
Pathobiology Research
mjms
Medical Sciences
http://mjms.modares.ac.ir
1
admin
2538-3000
2538-5887
en
jalali
1391
1
1
gregorian
2012
4
1
15
1
online
1
fulltext
fa
بیان و تعیین خصوصیات آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز باکتریایی در مخمر پیکیا پاستوریس با هدف تجزیه نوروتوکسینهای ارگانوفسفره
Expression and Characterization of Bacterial Organophosphorus Hydrolase in Pichia pastoris with the Intent to Degrade Organophosphate Neurotoxins
هدف: آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز آنزیم هومودیمری است که قادر به هیدرولیز پیوندهای فسفواستر و کاهش سمیت نوروتوکسین‏های ارگانوفسفره است. این خصوصیت آنزیم، ارگانوفسفر هیدرولاز را ابزار ارزشمندی برای تجزیه، تشخیص و زیست‏پالایی سموم ارگانوفسفره می سازد.
مواد و روش ها: در این مطالعه ژن آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز باکتری سودوموناس دیمینوتا پس از بهینه‏سازی برای مخمر پیکیا پاستوریس و تبدیل آن به فرم ترشحی (آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز به فرم غشایی در باکتری وجود دارد) در ناقل بیانی pPICZαB کلون شد. پس از ترانسفورم و القای مخمرهای نوترکیب، آنزیم به لحاظ تجزیه سموم، تعیین پارامترهای بیوشیمیایی و سینتیکی ارزیابی شد.
نتایج: آنزیم به میزان 49/7 مرتبه و با فعالیت ویژه 10<sup>3</sup> × 421/0 واحد در میلی‏گرم پروتئین و با بازده 33 درصد از محلول رویی محیط کشت، جداسازی و خالص سازی شد. آنزیم بهترین فعالیت و پایداری را تا دمای 50 درجه سانتی‏گراد و pH 7 تا 10 از خود نشان داد. با استفاده از سوبسترای پارااکسون، ثابت میکائیلیس (Km) و حداکثر سرعت آنزیم (Vmax) به‏ترتیب 96/45 میکرومولار و 23/11 میکرومولار در دقیقه محاسبه شد. آنزیم نسبت به کاتیون‏های دو ظرفیتی بسیار حساس بود و توسط عوامل واسرشته کننده نظیر سدیم دودسیل سولفات فعالیت خود را از دست داد. وزن مولکولی آنزیم با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE حدود 40 کیلودالتون تخمین زده شد.
نتیجه‏گیری: بر اساس نتایج بررسی حاضر آنزیم به‏طور مؤثری سموم ارگانوفسفره نظیر پارااکسون را تجزیه می کند. فعالیت و پایداری در pH و دماهای بالا و همچنین پایین بودن ثابت میکائیلیس آنزیم نسبت به انواع باکتریایی، آن را کاتالیزگر زیستی مناسبی برای کاربردهای زیست‏پالایی و تشخیصی می سازد.
Objective: Organophosphorus hydrolase (OPH) is a homodimeric enzyme that can hydrolyze phosphoester bonds and reduce the toxicity of organophosphorus compounds. This makes OPH a suitable element for the biodegradation of these compounds.
Methods: We successfully cloned the OPH gene from <em>Pseudomonas diminuta</em>, after optimization for <em>Pichia pastoris</em>, into a yeast expression vector (pPICZαB). After transformation and induction of recombinant yeasts, the expressed enzyme was investigated for its biochemical and kinetical parameters.
Results: The enzyme was purified 7.49-fold to a specific activity of 0.421×10<sup>3</sup> U/mg protein from the supernatant with a yield of 33%. The purified enzyme was able to degrade organophosphates. It had an optimal activity and stability up to 50°C, and a pH range of 7.0-10.0. The enzyme had a Km of 45.96 µM and a Vmax of 11.23 µM/min (421 µM/min/mg) for paraoxon as a substrate. This enzyme was sensitive to divalent cations and inactivated by denaturing compounds such as SDS. The molecular mass of the purified enzyme as estimated by SDS–PAGE analysis was approximately 40 kDa.
Conclusion: In this study, the purified enzyme effectively hydrolyzed paraoxon, an organophosphorus compound. The activity and stability of this enzyme at high temperatures and pH, and low Km in comparision with bacterial isolates could make it an attractive biocatalyst for applied bioremediation and biosensing
پیکیا پاستوریس,ترکیبات ارگانوفسفره,ارگانوفسفر هیدرولاز
Organophosphorus compounds,Organophosphorus hydrolase,Pichia pastoris
61
72
http://mjms.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-30-1000-2136&slc_lang=fa&sid=30
Saeed
Najavand
سعید
نژاوند
100319475328460066900
100319475328460066900
No
Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
Abbass
Sahebghadam Lotfi
عباس
صاحبقدم لطفی
100319475328460066901
100319475328460066901
Yes
1- Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
2- Department of Animal and Marine Biotechnology, National Institute of Genetics Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
1- گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
2- گروه زیست فناوری دام و آبزیان، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زی
Afshin
Mohsenifar
افشین
محسنی فر
100319475328460066902
100319475328460066902
No
Assistant Professor, Department of Toxicology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه سم‏شناسی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
Sareh
Arjmand
ساره
ارجمند
100319475328460066903
100319475328460066903
No
Department of Animal and Marine Biotechnology, National Institute of Genetics Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
گروه زیست فناوری دام و آبزیان، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
Ali
Mota
علی
مطاع
100319475328460066904
100319475328460066904
No
Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران