Pathobiology Research
Pathobiology Research
mjms
Medical Sciences
http://mjms.modares.ac.ir
1
admin
2538-3000
2538-5887
en
jalali
1389
10
1
gregorian
2011
1
1
13
4
online
1
fulltext
fa
تولید کلون و بررسی بیان توالی همپوشانی از ژن NS3 ویروس هپاتیت C بهوسیله سازه بیانی DNA
Cloning and evaluation of expression of a novel overlapping region of NS3 gene of Hepatitis C virus by expressing vector
هدف: هدف تولید یک سازه بیان کننده توالی یک ناحیه همپوشان از ژن NS3 از ویروس ایزوله ایرانی است.
مواد و روشها: ابتدا بخش میانی ژن NS3 با روش Nested-RT-PCR و با استفاده از سرم بیمار مبتلا به ژنوتیپ 1a ویروس هپاتیت C تکثیر شد. بعد از کلون آن درون ناقل کلونینگ TA و غربالگری کلونها براساس روش سفید- آبی و Colony-PCR این کلونهای منتخب با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی با BglII ارزیابی شد. توالی جدید با استفاده از نرمافزار با توالیهای دیگر مرجع مقایسه و درخت تکاملی ترسیم شد. بخش میانی ژن NS3 تأیید شده و سپس به درون سازه بیانی، کلون شد و کلونهای مناسب با استفاده از دو نوع Colony-PCR شناسایی شد. ارزیابی نهایی بیان ژن با مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات روی سلولهای ترانسفکت شده با سازه بیانی تأیید شد.
نتایج: توالی میانی NS3 از روی سرم بیمار تکثیر و نتایج توالییابی و مقایسه ژنی نشان داد که این توالی به توالیهای مرجع شباهت داشته و در شاخه ژنوتیپ 1 ویروس هپاتیت C قرار دارد. با روش Colony-PCR وجود و نیز جهت ژن درون پلاسمید بیانی تأیید شد. مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات بهترتیب نمایانگر انتقال موفق سازه، بیان ژن و نیز تولید پروتئین در سلولهای 293 بود.
نتیجهگیری: سازه بیانی حاوی بخش میانی ژن NS3 که بایستی فاقد فعالیت پروتئازی باشد، نسبت به طول کامل ژن NS3 میتواند در القای بهتر ایمنی توسط سلولهای عرضه کننده آنتی ژنی در موارد واکسن ویروس هپاتیت C مفیدتر واقع شود.
Objective: In this project, our aim was to construct a novel expressing vector harboring a new sequence from overlapping region of NS3 gene of HCV from infected Iranian patient.
Materials and Methods: The partial NS3 (pNS3) gene was amplified by Nested-RT-PCR method using sera of HCV infected patients harboring genotype 1a. After purification and cloning the pNS3 into TA-cloning vector, the best colony was selected based on Blue/White screening and colony-PCR following by confirmation with sequencing and restriction digestion with BglII. The sequenced gene was compared with other reference sequences using alignment softwares. The resultant pNS3 gene subcloned into the expression vector, IRES vector, followed by selection the suitable clones by 2 different colony-PCRs. The gene expression was evaluated using GFP detection, RT-PCR and western blotting techniques after transfection of the IRES-pNS3 vector into the 293 cell line.
Results: After pNS3 sequence amplification by RT-PCR, sequencing results showed high homology among the sequences with other reference sequences. This result also showed that it belonged to genotype 1 of HCV. Colony-PCR showed the insertion of gene into expressing vector with the right orientation. GFP expression, RT-PCR and western blotting confirmed transfection of vector, expression of pNS3 gene and production of its protein in 293 cells respectively.
Conclusion: This novel expressing vector harboring partial region of NS3 gene in compare to full NS3 gene maybe more useful in immune induction by antigen presenting cells due to absence of genes responsible for protease activity of the protein in the setting of HCV vaccine.
ویروس هپاتیت C,سازه DNA,ژن NS3
HCV Virus,NS3 Gene,DNA Construct
0
0
http://mjms.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-30-1000-2836&slc_lang=fa&sid=30
seyed-Younes
Hosseini
سید یونس
حسینی
100319475328460066462
100319475328460066462
No
شیراز، بلوار زند، بیمارستان نمازی، مرکز تحقیقات گوارش و کبد
farzaneh
Sabahi
فرزانه
صباحی
100319475328460066465
100319475328460066465
Yes
Department of Virology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran
گروه ویروسشناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران
Mohamad Hossein
Modarresi
محمد حسین
مدرسی
100319475328460066466
100319475328460066466
No
گروه ژنتیک پزشکی ، دانشگاه علوم پزشکی تهران
Seyed Mohammad
Moazzeni
سید محمد
مؤذنی
100319475328460066467
100319475328460066467
No
Department of Immunology, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ایمنیشناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
mehdi
Saberi firoozi
مهدی
صابری فیروزی
100319475328460066468
100319475328460066468
No
مرکز تحقیقات گوارش و کبد
Mehrdad
Ravanshad
مهرداد
روانشاد
100319475328460066469
100319475328460066469
No
Department of Virology, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ویروس شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
Davood
Mehrabani
داوود
مهربانی
100319475328460066470
100319475328460066470
No
مرکز تحقیقات گوارش و کبد شیراز
Majid
Mojarrad
مجید
مجرد
100319475328460066483
100319475328460066483
No
Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran
گروه ژنتیک پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران