Pathobiology Research
Pathobiology Research
mjms
Medical Sciences
http://mjms.modares.ac.ir
1
admin
2538-3000
2538-5887
en
jalali
1387
5
1
gregorian
2008
8
1
10
پاییز و زمستان86-
online
1
fulltext
fa
عدم کارایی shRNA اختصاصی بر علیه ژنE1A درکاهش بیان پایدار در سلولهای HEK 293
Inability of specific shRNA for stable reduction of E1A gene expression in HEK293 cell line
هدف: انکوپروتئین E1A در آدنوویروس تیپ 5 یک فاکتور تنظیمی است که موجب کنترل فرایند رونویسی ژنهای آدنوویروس میشود. این پروتئین با تغییر در عملکرد پروتئینهای مهم سلولی از جمله p21 و pRb سبب ایجاد شرایط مساعد برای همانندسازی ژنوم ویروس و ترانسفورم شدن سلولهای میزبان میشود. هدف از تحقیق حاضر مهار پایدار بیان ژن E1A در سلولهای HEK 293 با استفاده از روش RNAi بوده تا آثار این مهار روی سلولهای فوق بررسی شود.
مواد و روشها: ناحیه پروموتر U6 و shRNA از دو پلاسمید اهدایی کنترل و پلاسمید کدکننده siRNA اختصاصی علیه ژن E1A بهنامهای pSP81-E1A و pSP-81 در پلاسمید pcDNA3.1 سابکلون شد. سپس سازههای ساخته شده با روش لیپوفکشن به سلولهای سرطانی HEK 293 ترانسفکت و کلونیهای سلولهای ترانسفورم شده بر اساس مقاومت به آنتیبیوتیک نئومایسین انتخاب شدند. تغییرات حاصل از این عمل روی بیان ژن E1A با استفاده از روش RT-PCR بررسی شد.
نتایج: بررسیها نشانگر عدم تفاوت در میزان بیان ژن E1A در پی ترانسفکشن سلولها با پلاسمیدهای مورد نظر در دو گروه مهار و کنترل بود. برای بررسی احتمال تأثیر روند کلونینگ بر عملکرد پروموترU6 ، سلولها با پلاسمیدهای اهدایی نیز ترانسفکت شدند که مجدداً عدم مهار بیان ژن E1A مشاهده شد.
نتیجهگیری: نتایج نشان دادند که با وجود تکرار آزمایش هکرمهار قابل توجهی صورت نگرفت. برای کسب اطمینان از صحت توالی ژن E1A، قطعه تکثیر شده در فرایندPCR ، که شامل ناحیه s13 این ژن است، توالییابی شد. نتایج حاصل از توالییابی با وجود جهش در یک نوکلئوتید در ناحیهای بود که بهعنوان هدف برای siRNA انتخاب شده بود. بنابراین میتوان علت عدم مهار را به وجود این جهش در ترادف ژن E1A در سلولهای استفاده شده در این مطالعه مربوط دانست.
Objective: E1A oncoprotein of adenovirus type 5 is a regulatory factor which controls transcription of other adenovirus genes. This protein promotes both viral genom replication and host cell transformation by altering the function of certain important cellular proteins such as p21 and Rb. The aim of the present study was to constantly reduce the expression of E1A gene in HEK 293 cell line by RNAi technique in order to analyse the effects of this suppression on these cells.
Materials and Methods: The U6 promoter and shRNA regions from the control and E1A specific siRNA coding plasmid as pSP-81 and pSP81-E1A were subcloned into pcDNA3.1. Then these constructs were transfered into the HEK 293 cancerous cells using lipofection method and successfully transfected cell colonies were selected based on neomycin antibiotic resistance. Changes in E1A gene expression were analysed by RT-PCR technique after selection process.
Results: Final analysis showed no obvious difference in E1A gene expression level in the suppresed and control groups, upon transfection with the constructed plasmids. In order to examine the possible influence of cloning procedure on the function of U6 promoter, cells were transfected with Dr. Hacker’s original plasmids, but no inhibition of E1A gene expression was observed again. The results of sequencing revealed existence of a mutation in the siRNA target region for the E1A gene sequence.
Conclusion: These results illustrated that no considerable suppression has been occurred by repeating Dr. Hacker’s expriment, even with application of very effective lipofection method. To examine the sequence of the E1A gene, the PCR product of the 13s region of the gene was sequenced. Sequencing revealed existence of a point mutaion in the siRNA target region. It seems that observed impaired interference could be attributed to this mutation in the E1A gene of the studied cells.
آدنوویروس تیپ 5
RNAi,E1A,HEK 293,shRNA,RNAi,E1A,HEK 293,shRNA,Adenovirus type 5
95
103
http://mjms.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1000-72&slc_lang=fa&sid=30
Haleh
Vosgha
هاله
وثقی
100319475328460066319
100319475328460066319
No
Department of Genetics, Faculty of Basic Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
Mehrdad
Behmanesh
مهرداد
بهمنش
100319475328460066320
100319475328460066320
Yes
Department of Genetics, Faculty of Basic Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
Majid
Sadeghizadeh
مجید
صادقیزاده
100319475328460066321
100319475328460066321
No
Department of Genetics, Faculty of Basic Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران